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磁珠广泛应用于多种分子生物学实验,包括核酸提取与纯化、NGS建库片段筛选、序列特异性捕获;以及多种免疫学实验,如蛋白纯化与免疫(共)沉淀、细胞分离与激活。
表面带有负电基团的磁性微球能够在不同的缓冲环境可逆地结合与释放核酸分子,因此经常用于自动化核酸提取试剂盒的开发。Magnetar MS500-SiOH和 –COOH两款磁珠经实验证明可用于从多种样本中提取DNA和RNA,样本种类包括全血、血浆、血清、鼻/咽拭子、细胞裂解液、福尔马林固定的组织、动植物切片等等。
在NGS文库构建工作流中,通常会涉及到文库纯化以及片段筛选过程;最重要的步骤之一是在超声打断后去除过大和过小的核酸片段,只保留尺寸适中的片段用于文库构建,此过程称为片段筛选;对扩增后的体系进行离子、dNTP、引物及聚合酶等物质的去除,称为产物纯化,二者皆为磁珠在NGS平台极其重要的应用。
磁珠在序列特异性捕获场景中应用广泛,捕获原理是将与靶标序列互补的核酸探针偶联到磁珠上,即可通过杂交捕获的方式富集所需的靶标序列分子。
将磁珠用于自动化的蛋白纯化过程可以大大提高实验的方便程度,同时改善结果的重复性。在免疫(共)沉淀实验中,推荐使用MP3(3.0 μm)磁性聚合物微球。当进行小规模高通量的蛋白纯化实验,如抗体纯化时,MA 系列磁珠则更为合适。
免疫磁珠法细胞分选是高效简捷的细胞分离纯化方法,当用作阳性分选时,由于磁珠会不可逆地结合在细胞表面,因此分离得到的细胞只适合用于分子生物学类实验(因细胞后续会被裂解)。如果分选的细胞需要用于培养或者流式分析,则最好使用阴性分选。
免疫试剂的开发建立在抗原和抗体特异相互作用的基础上,其原理是利用高度特异性和灵敏度的抗原抗体反应,检测样本中有无相应的抗体或抗原,在此基础上通常会引入微球或磁珠等载体,以提高试剂的灵敏度等特性,同时也更适用于自动化仪器分析。
表面包被有特异性配基的乳胶微球,当遇到样本中待测物的时候会通过免疫相互作用产生特异性凝集,这是乳胶增强比浊法的基本原理。微球的凝集会使得微球分散液的散射光强度上升,上升的程度与样本中待测物的浓度可以建立定量的相互关系。
彩色和荧光聚苯乙烯微球均可用作定性和定量免疫层析检测试剂中的标记物,用于产生可识读的信号。红色和蓝色的微球在定性免疫层析检测中最为常用,它们能够产生肉眼可见的C线和T线。而在开发定量免疫层析检测试剂的时候,含有铕(Eu)配合物的荧光微球是最适合的选择。
基于流式细胞术或者荧光成像法的单颗粒检测使得人们能够在单次测试中对多种待测物的浓度进行测定。该方法需要可区分的微球作为载体,最常用的方法是向微球内部加入不同量和种类的荧光染料,通过荧光强度和波长的区分实现对微球的“编码”。
磁微粒化学发光法已成为目前全自动免疫检测中最常用的方法。该方法多使用粒径在1 – 3 μm之间的磁性微球作为分离载体。大粒径磁珠在磁场中移动快,能够缩短清洗所需的时间,对设备的普适性也较好。而小粒径磁珠具有更大的比表面积,适合用于对检测灵敏度要求较高的试剂项目开发。
多种检测的设备的校准需要用到具有准确粒径和数量浓度的标准微球。除了粒度和计数的校准之外,微球还可用于荧光检测仪器中各荧光通道信号强度以及光路聚焦的校准。
光学和电子显微镜作为实验室长度测量最常用的工具,其测值准确度需要使用具有准确粒径且粒径分布高度均一的微球标准品进行检验和校准。光学显微镜通常使用微米级的标准微球,而电子显微镜使用的标准微球粒径则在纳米级到亚微米级范围。
液相与气相颗粒计数仪对水和空气中的不溶性颗粒物进行准确的浓度测定,是生物制药、环境检测、半导体加工等领域重要的检测设备,其计数准确性需要使用同时有准确粒径和数量浓度的微球标准品进行定期校验。
现代荧光显微镜通常有多个检测通道,由滤光片组或者光栅实现固定激发与发射波长范围的组合,每个检测通道的成像质量、光源的状态、检测器的灵敏度和线性都需要荧光微球标准品进行定期校验。
流式细胞仪是高度复杂的检测设备,结合了颗粒计数、荧光检测和定量分析的功能。流式细胞仪日常使用需要专门的荧光微球确认性能,在出厂前以及某些定量检测中还需要专门的微球进行光路校直、计数内标、补偿调节等一系列校验工作。